微條形碼技術是一種通用技術，可為生物、醫(yī)學和材料科學領域的微米和納米級應用程序提供多重和高通量信息存儲。但是，當前的熒光條形碼技術主要使用光譜多路復用和熒光強度（FI）編碼，它們通常容易受到編碼元素的光譜重疊的影響。此外，由于樣品濃度和外部微環(huán)境的可變性，很難獲得定量的讀數(shù)。利用熒光壽命（fluorescence lifetime），在微條形碼區(qū)域能提供可重現(xiàn)輸出。借助最新的顯微成像技術，熒光壽命可以用作一種簡單的技術，最大程度地降低傳統(tǒng)熒光條形碼的局限性，隨著時間的推移提供可重復且定量的讀數(shù)。但是，尋找能夠靈活調節(jié)熒光壽命的響應材料仍然是一項持續(xù)的挑戰(zhàn)。
研究成果
基于以上問題，來自英國伯明翰大學化學學院的Rachel K. O’Reilly教授課題組設計了一種由兩種成分組成的光可切換（photo-switchable）納米凝膠，該凝膠在通過光輻照引起的光致異構化誘導的能量轉移過程中表現(xiàn)出可變的熒光壽命?？梢允褂脽晒鈮勖上耧@微鏡（FLIM）直觀地繪制這種遠程操縱的熒光壽命特性，從而可以在微尺度上選擇性地存儲和顯示信息。并且，在細胞器成像中，可將活細胞和亞細胞細胞器的熒光壽命成像中的背景影響降至最低。相關成果以“Manipulating the fluorescence lifetime at the sub-cellular scale via photo-switchable barcoding”為題，發(fā)表在《Nature communciation》上。
圖文解析
1. 光開關納米凝膠的設計與制備
作為一種非破壞性性刺激，光是用于無需外部接觸即可進行外部操縱的重要工具之一，因此非常適合信息標記、實時標記和選擇性跟蹤。在這項研究中，研究者設計了一種基于光的可切換壽命條形碼系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于包含取代的馬來酰亞胺（DTM）和螺吡喃（SP）開關的兩組分納米凝膠。通過誘導可逆的光異構化過程，可以通過DTM熒光基團與SP光致變色劑的開環(huán)形式之間的F?rster共振能量轉移（FRET）實現(xiàn)具有相似結構但具有多重壽命的納米凝膠，從而實現(xiàn)了可控的、非可控的動態(tài)熒光壽命編碼。
2. 評估光異構化過程中的能量轉移和光物理行為
DTM在交聯(lián)的聚合物環(huán)境中受到保護，在450-600 nm范圍內發(fā)出綠色光，并具有高的熒光量子產(chǎn)率。相比之下，在500和600 nm之間，SP的閉環(huán)形式的吸收可忽略不計，而光致變色染料的開環(huán)形式在此波長范圍內吸收，為高效FRET提供了理想方案（圖2a）。時變密度泛函理論（TD-DFT）計算表明，僅當SP作為開環(huán)異構體存在時才發(fā)生FRET（圖2b）。
當在大約25nm激發(fā)時，DTM的熒光發(fā)射在納米凝膠環(huán)境中保持綠色發(fā)射（450-600 nm）。相反，在輻照同時包含DTM和SP的納米凝膠（N2-4）時，DTM通道中的綠色發(fā)射逐漸減少，并在610 nm附近出現(xiàn)了一個新峰，表明FRET供體/DTM和開環(huán)的SP之間形成了一對受體（圖2c）。如預期的那樣，可以通過用可見光照射完全恢復DTM發(fā)射，在此期間，通過將SP切換回閉環(huán)形式來阻止FRET過程。
3. 光刺激的可逆熒光壽命
時間相關單光子計數(shù)（TCSPC）的熒光壽命成像顯微鏡被用作解碼技術，用于可視化局部熒光壽命。首先通過監(jiān)測不同發(fā)射波長下的壽命衰減來比較二維時間分辨的熒光衰減光譜。可以觀察到了DTM通道中N4溶液的熒光壽命降低，由于受光刺激的FRET，開環(huán)SP的新的熒光衰減出現(xiàn)在600至650 nm之間。如圖3a，b所示，UV照射后，N1-4中的平均壽命可以從15 ns調整到28 ns，而且與兩種單體的比例線性相關。此外，通過調整到達穩(wěn)定階段之前的紫外線照射時間，可以在同一納米凝膠中獲得多個壽命（圖3c，）。N4的整個壽命衰減在UV和可見光的4個循環(huán)中是完全可逆的，沒有任何可測量的變化（圖3d）。通過熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）進一步可視化了這種可逆行為，其中可以觀察到不同的壽命。
4. 活細胞中可逆的熒光壽命條形碼
最后，研究者試圖研究在細胞結構中的細胞內編碼和解碼過程。為了靶向線粒體，在通過疊氮化物反應基團官能化納米凝膠后，通過疊氮炔環(huán)加成將TPP與納米凝膠偶聯(lián)（圖4a）。通過共聚焦熒光分析，在TPP-N6的DTM通道和商用Mito Tracker的紅色通道之間觀察到共定位，TPP-N6的皮爾遜相關系數(shù)（PCC）為0.85，而沒有TPP修飾（0.57）的納米凝膠，表明這些材料在線粒體內的成功定位（圖4b）。而且，跟蹤劑基團的并入不會影響納米凝膠系統(tǒng)的可逆性。與具有自發(fā)熒光效應的傳統(tǒng)壽命條形碼材料相比，這種納米凝膠系統(tǒng)中熒光壽命的可逆性提供了一種策略，可通過減少信號強度來放大信噪比。
總結
在本文中，研究者開發(fā)了一種通過光致異構化誘導的FRET過程來遠程控制聚合物納米凝膠中熒光壽命。這些納米凝膠系統(tǒng)進一步用于使用FLIM進行熒光壽命條形碼掃描，從而達到可控、可逆和非侵入性方法跟蹤并選擇性地可視化熒光多態(tài)的目的。通過同時提取壽命作為讀數(shù)，納米凝膠系統(tǒng)能夠選擇性地以定量結果進行解碼，從而允許以微尺度存儲信息。作為概念驗證，通過點擊反應將線粒體追蹤劑引入納米凝膠，從而獲得亞細胞規(guī)模的活細胞壽命條形碼，提高了成像的靈敏度。
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